Dipartimento di Medicina Clinica e Molecolare

Il presente progetto di ricerca, dal carattere fortemente traslazionale, si propone di identificare e validare nuovi bersagli terapeutici presenti nel microambiente tumorale immunitario (TIME) e responsabili della progressione tumorale e della resistenza agli attuali approcci di immunoterapia con inibitori dei checkpoint immunitari.
A tal fine vengono utilizzate moderne tecnologie omiche unitamente ad approfondite analisi bioinformatiche per una caratterizzazione del TIME di pazienti affetti da adenocarcinoma del polmone (LUAD).
La raccolta ed il processamento di versamenti pleurici maligni (MPEs) è finalizzata a ricreare sistemi ex vivo quanto più possibile vicini ai tumori dei pazienti.
Il team interdisciplinare coinvolto nell'esecuzione del progetto è costituito da 4 Unità Operative (U.O.) composte da oncologi medici, patologi, biologi, immunologi operanti presso due diverse istituti che sono il Dipartimento di Medicina Clinica e Molecolare (DMCM) di Sapienza Università di Roma e l’IRCCS Istituto Nazionale Tumori Regina Elena (IRE).
Le U.O. guidate dalla prof.ssa Rita Mancini e dal prof. Paolo Marchetti presso il DMCM e quelle guidate dal dott. Maurizio Fanciulli e dalla dott.ssa Paola Nisticò presso l’IRE hanno lavorato in maniera sinergica per la realizzazione del programma sperimentale articolato in tre principali attività:

1. Espansione di una biobanca ottenuta da MPEs di pazienti LUAD
2. Identificazione di bersagli terapeutici del microambiente immunitario
3. Validazione dei bersagli in modelli ex vivo mediante saggi immuno-funzionali

• Task1 (mesi 1-18). Relativamente al primo task del progetto, il lavoro svolto dalle UO dirette dal Prof. Marchetti e dalla Prof.ssa Mancini è risultato nell’arruolamento di 20 nuovi pazienti con diagnosi di LUAD complicata da MPEs. I campioni di MPEs e di sangue raccolti sono stati processati ed adeguatamente conservati ed in parte utilizzati per gli scopi specifici di questo progetto. Questo ha permesso di ampliare la collezione di campioni già presente e di ottenere 4 nuove linee tumorali attivamente proliferanti, con un tasso di successo del 20% come stimato in fase di stesura progettuale. Il materiale raccolto è stato funzionale allo sviluppo delle attività previste per i task 2 e 3 del progetto.
• Task2 (mesi 4-20). Il secondo task2 del progetto prevedeva l’utilizzo di moderne tecnologie per effettuare una caratterizzazione su larga scala del panorama delle cellule immunitarie e del loro stato di attivazione nel microambiente tumorale delle MPEs. Grazie al lavoro coordinato della UO diretta dal Dott. Fanciulli e dell’unità di bioinformatica dell’IRE, durante i primi 8 mesi previsti si è proceduto con il sequenziamento totale dell’RNA (RNA Seq) estratto da PEMC e PBMC di 5 pazienti LUAD e 4 donatori sani. Inoltre, i campioni di nove pazienti aggiuntivi sono stati utilizzati per la validazione, tramite Real time PCR dei dati ottenuti tramite RNA Seq. Tutti i dati grezzi ottenuti e le relative analisi bioinformatiche sono stati depositati online, con accesso libero, al seguente link https://gitlab.com/bioinfo-ire-release/bruschini_pallocca_etal. Inoltre, come previsto da progetto, l’UO coordinata dalla Dott.ssa Nisticò ha proceduto con l’analisi ad ampio spettro dei fattori solubili rilasciati nel microambiente delle MPEs e che mediano l’attivazione o l’inattivazione, nonché il reclutamento di cellule immunitarie nel sito tumorale. L’analisi è stata effettuata sulle MPEs e sul plasma di 15 pazienti LUAD e 4 donatori sani, come controllo. Le analisi a singola cellula effettuate su dati di scRNA Seq ottenuti dalle MPEs di pazienti LUAD hanno permesso di analizzare con una maggior risoluzione il compartimento dei macrofagi presenti nelle MPEs e di individuare nello SCGFβ, il fattore solubile più rappresentato nelle MPEs, un possibile attore chiave nel mediare un cross talk tra fibroblasti e cellule immunitarie all’interno dei versamenti pleurici, almeno in parte responsabile dell’instaurarsi di un ambiente pro-tumorale ed immunosoppressivo.
• Task3 (mesi 6-24). Relativamente al terzo ed ultimo task del progetto, il lavoro svolto si è avvalso delle competenze delle UO dirette della Prof.ssa Mancini e della Dr.ssa Nisticò, nel campo della messa in coltura di cellule primarie e di cellule immunitarie. Come riportato infatti nella sezione precedente (figure 8 e 9), è stato possibile mettere a punto saggi funzionali in vitro per valutare la capacità delle MPEs di indurre polarizzazione dei macrofagi verso un fenotipo M1/M2, nonché la capacità di stimolare la migrazione di cellule tumorali primarie isolate dalle MPEs degli stessi pazienti. Grazie all’esperienza della UO diretta dalla Dr.ssa Nisticò nel campo dell’isolamento e messa in coltura di CAFs e della UO della Dr.ssa Mancini nell’isolamento di linee tumorali primarie derivanti da MPEs (task1 del presente progetto) è stato inoltre possibile validare l’espressione di uno dei fattori solubili risultato più interessante, grazie all’integrazione delle analisi bioinformatiche e dei risultati sperimentali (attività svolta durante tutto il secondo anno di progetto), su linee cellulari (sia del microambiente che tumorali) derivate direttamente da pazienti LUAD.